Флоровский монастырь существовал еще до опустошения Киева Менгли-Гиреем (1482 г.). Первое документальное свидетельство о монастыре – грамота от 1566 г. польского короля Сигизмунда ІІ Августа киевскому/ Сейчас в обители все богослужения проходят в Вознесенском соборе. Все храмы (кроме разрушенного Свято-Троицкого) возвращены монастырю. Восстанавливается Казанский храм. Как и в былые времена, Флоровский монастырь является своекоштным (необщежительным). воеводе князю Константину Константиновичу Острожскому. В ней говорится о закреплении за протопопом Яковом Гулькевичем и его потомками-священниками права удерживать здавна существовавший монастырь при церкви свв. Флора и Лавра и чинить там службу по греческому обычаю и закону, т.е. совершать православные богослужения. В 1632 г., при свт. Петре (Могиле), Митрополите Киевском, внук о. Якова, Иоанн Богуш-Гулькевич, ставший иноком Лавры, отказался от своих наследственных прав на Флоровскую обитель в пользу игумении Агафии (Гуменицкой) и по ней наступаючей игумении… и законницъ теперешнихъ и напотомъ будучихъ. Непременное условие: монастырь должен принадлежать Православной Церкви.
В 1711 г. по воле Императора Петра I ко Флоровскому был присоединен Вознесенский женский монастырь (основан в начале XVII в.), находившийся напротив Св. врат Лавры (ныне на этом месте – бывший арсенал Киево-Печерской крепости). Вознесенский собор освящен в 1732 г. Остальные храмы (Воскресенский, Казанский, трапезный Тихвинский и кладбищенский Свято-Троицкий), келейные корпуса и др. здания устроены в XIX в. (после опустошительного пожара 1811 г.). До 1920-х годов в монастыре находилась чудотворная Руденская икона Божией Матери (праздн. 13 / 26 июля).